нанася се един overlay, а в средната част - два overlay-а с минимална стъпка между тях, които указват границите на входящите и изходящите клонове на лентата. Стъпката между наслагванията на предстоящия клон на лентата се определя с помощта на зависимостта на аритметична прогресия, а на низходящия клон - на базата на геометрична прогресия. В този случай трябва да се зададе първият член на аритметичната прогресия и да се вземе предвид, че последната празнина между облицовките на предстоящия клон на лентата е първият член на геометричната прогресия, а разликата и знаменателят на прогресиите са определена от общата празнина между облицовките на всеки клон на лентата.

При барабанно-челюстната спирачка изравняването на специфичните натоварвания се постига чрез поставяне в многосекционна спирачна челюст върху нейните входящи и изходящи части на радиално подвижни накладки, свързани помежду си с балансьор, т.е. използва се принципът на конвенционалните тежести. Това техническо решение е защитено с авторско свидетелство за изобретение.

Стабилизирането на повърхностните температури в триещите се двойки на горепосочените спирачни устройства се постига благодарение на термоелектрическия ефект с помощта на термоелектрически батерии, работещи в режимите на термоелектрически хладилник и термоелектрически генератор в облицовките на входящите и изходящите клонове на лентата, т.к. както и във входящите и изходящите секции на фрикционните накладки на обувката в основните и допълнителни серво спирачки, в зависимост от топлинното натоварване на техните фрикционни възли. В същото време се предоставя

преразпределение на топлинната енергия между повърхностите на фрикционните възли на спирачките, което води до нейното квазистабилизиране. Работата на термобатареи в горните режими е теоретично обоснована.

Счита се за рационално управление на режимите на работа на спирачната лента с челюст, при условие че нивото на топлинно натоварване на повърхностните слоеве на фрикционните накладки не надвишава допустимата температура за техните материали. За осъществяване на управлението на режимите на спиране може да се използва комбинирано охлаждане (термоелектрическо с топлинна тръба) на фрикционни спирачни двойки.

В резултат на прилагането на това техническо решение се постигна повишаване на ефективността на спирачната лента на лебедката U2-5-5.

По този начин са посочени начините за управление на динамичното и топлинно натоварване на фрикционните възли на спирачните устройства.

ЛИТЕРАТУРА

1. Декларация Пат. 63418А (Украйна). Метод за контролиране на специфични натоварвания върху входящите и изходящите клонове на спирачната лента на спирачната лента с челюст / A.I. Волченко, В.В. Дячук, Н.А. Волченко и други - Б.И. - 2004. - № 1. - На украински. език

2. А.с. 1682675 А1 СССР. Спирачка с барабанна челюст / A.I. Волченко, В.В. Москалев, П.А. Скороход и други - B. I. - 1991. -

3. Pat. 2221944 C1 Русия. Охладителни системи за спирачен механизъм със серводействие и метод за неговото изпълнение / A.I. Волченко, А.А. Петрик, Н.А. Волченко и други - B.I. - 2004. - № 2.

Катедра техническа механика

Постъпила на 22.11.04г

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОХРАТОКСИН А В ГРОЗДОВИ ВИНА

Е.Н. РИКУНОВА, Т.И. ГУГУЧКИНА

Севернокавказки зонален изследователски институт по градинарство и лозарство

Сред микотоксините охра токсините заемат специално място. Те се произвеждат от някои видове микроскопични гъбички от родовете Penicillium, Aspergillus, по-специално A. ochraceus, P. viridicatum. Тези плесени са навсякъде, най-вече в топли и влажни условия, причинявайки гниене на гроздето при продължителни дъждове. Охратоксините имат общотоксичен ефект, засягат бъбреците, черния дроб, намаляват продуктивността, имат ембриотоксичен, мутагенен и канцерогенен ефект.

Международната агенция за изследване на рака класифицира охратоксина като потенциален канцероген и го класифицира като клас на опасност 2B. При замърсена храна с охратоксини човек се разболява от балканска ендемична нефропатия.

Преди това Patu-lin се намираше във винени продукти, а наскоро се появи информация за съдържанието на охратоксин А. Замърсява зърнени храни, зеленчуци, плодове и техните продукти, фуражи, малц, бира, сокове и вино.

Ние разработихме метод за определяне на охратоксин във вино от грозде чрез тънкослойна хроматография (TLC).

Тънкослойната хроматография е вид течна хроматография в слой от сорбент, който е плосък от едната страна и е отложен върху плосък твърд субстрат. Основните характеристики на TLC се дължат на движението на елуента (разтворителя) над сорбентния слой поради капилярните сили, което опростява и улеснява хроматографския процес. Използването на универсален сорбент - силикагел и отворен слой осигуряват лекота на нанасяне на пробата, възможност за едновременен анализ на няколко проби и лесно наблюдение на процеса на елуиране.

Тънкослойната хроматография включва пречистване и концентриране на микотоксини. За това се използва двуизмерна или стъпкова хроматография.

fiu. Първият етап на елуиране е пречистване, отделяне на интерфериращи вещества, вторият етап е отделяне на микотоксини.

Анализът на винена проба чрез TLC включва етапите на подготовка на проба, плоча, хроматографска камера и елуенти, както и концентриращ патрон Diapak C16MT; след това действителната хроматография, изпаряване на елуента от плаката, идентификация, количествено определяне и документиране.

Предимството на метода е не само неговата простота, достъпност, възможността за използване на специфични проявяващи агенти, потвърждаващи, че веществото принадлежи към желаното, по-ниски изисквания за пречистване на екстракти, но и възможността за определяне на малки количества охратоксин - границата на откриване е 0,1 μg / cm3.

За определяне на микотоксин охратоксин А във вино и виноматериали, 10 cm3 от пробата преминават през концентриращ патрон Diapak C16MT, като пробата се концентрира 10 пъти и накрая се пречиства с 1 cm3 ацетонитрил. Полученият екстракт в количество 5 μl и стандартът се нанасят върху тънкослойна хроматография и се извършва хроматографско разделяне (елуиране) в подготвена хроматографска камера с подходящи елуенти. Системата от разтворители под формата на изопропанол и амоняк се оказва най-оптимална за отделяне на микотоксина. Той е доста летлив и има нисък коефициент на задържане.

Rf на сорбента. Микотоксиновите петна се образуват чрез облъчване с ултравиолетова светлина с дълга дължина на вълната (365 nm). Когато са изложени на ултравиолетови лъчи, петната от микотоксини светят в синьо-зелено.

Идентифицирането и количественото определяне на охратоксина се извършва чрез сканираща дензометрия на денситометър Sorbfil със специализирана програма за обработка на резултатите от анализа и изчисляване на параметрите на хроматограмата.

Използването на денситометър прави TLC метода количествен, сравним по разделителна способност с HPLC, като същевременно запазва всички предимства на TLC.

Предложеният метод е тестван върху проби от вино с предварително въвеждане на определени количества охратоксин. Методът ви позволява бързо и точно да контролирате съдържанието на охратоксин във винените продукти.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кретова Л. Глунев Л. И. Микотоксини. Замърсеност на продуктите и аналитичен контрол. - М.: Агрпрогресс, 2000.

2. Протоколи от събранието на OIM. - Париж, 2000. - С. 57-59.

3. Ръководство за съвременна тънкослойна хроматография / Ed. О.Г. Ларионова // Въз основа на материалите на училищен семинар по тънкослойна хроматография. - М., 1994.

Лаборатория по технология на винопроизводството

Постъпила на 08.09.04г

Н.Т. СИЮХОВА

Майкопски държавен технологичен университет

В момента се обръща сериозно внимание на проблемите на замърсяването на селскостопанските култури с токсични вещества от различно естество, включително пестициди. Сред най-третираните с химически средства за защита срещу неприятели и болести култури се откроява лозата. Поради многократните защитни обработки през всеки вегетационен период, лозята отдавна са смятани за своеобразен акумулатор на опасни за околната среда химикали.

Те включват органофосфорни съединения, които се характеризират с повишен риск от натрупване в обработваемите площи и са водещи по отношение на практическото приложение. Тези лекарства се натрупват в растителните клетки. Горските плодове са най-опасно и интензивно замърсени с тях, което в крайна сметка се отразява на качеството и екологичната безопасност на продуктите, произведени от грозде. Като се има предвид високата токсичност и стабилност на органофосфорните съединения и техните метаболити, определянето на замърсяването на гроздови продукти от тях е от голямо научно и практическо значение.

В производствените обекти на специализираното стопанство AF "Fanagoria" (район Темрюк) е извършен (1999-2002) токсикологичен контрол на червени сортове грозде. Взети са проби по време на беритбата, а анализът на продуктите за съдържание на остатъчни количества хлорорганични и фосфорни инсектициди е извършен в акредитирана изпитвателна токсикологична лаборатория на СКЗНИИСиВ. Принципът на подбор на гроздови парцели за вземане на проби се основава на факта, че събраната от тях гроздова реколта се използва за фабрична обработка и приготвяне на сухи червени вина в микровинарския цех на лабораторията за преработка на грозде на SKZNIISiV.

При планирането на експерименти за изследване на устойчивостта на токсични вещества в гроздето е взето предвид възможното влияние на два фактора, които заедно определят проявата на потенциалната опасност от навлизане на инсектициди в култивираното грозде: проникването на токсични остатъци от почвата на насажденията и от самото растение в резултат на текущите сезонни третирания

Страница 1

страница 2

страница 3

страница 4

страница 5

страница 6

страница 7

страница 8

страница 9

страница 10

страница 11

страница 12

страница 13

страница 14

страница 15

страница 16

страница 17

страница 18

страница 19

МЕЖДУДЪРЖАВЕН СЪВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИЯ, МЕТРОЛОГИЯ И СЕРТИФИКАЦИЯ

МЕЖДУДЪРЖАВЕН СЪВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИЯ, МЕТРОЛОГИЯ И СЕРТИФИКАЦИЯ

МЕЖДУДЪРЖАВЕН

СТАНДАРТ

ЗЪРНО И ПРОДУКТИ ОТ НЕГОВАТА ПРЕРАБОТКА, КОМБИНИРАН ФУРАЖ

Определяне на охратоксин А чрез високоефективна течна хроматография

(ISO 15141-1:1998, NEQ)

Официално издание

Стандартинформ

Предговор

Целите, основните принципи и основната процедура за извършване на работа по междудържавна стандартизация са установени от GOST 1.0-92 „Междудържавна система за стандартизация. Основни разпоредби” и ГОСТ 1.2-2009 „Междудържавна система за стандартизация. Междудържавни стандарти, правила и препоръки за междудържавна стандартизация. Правила за разработване, приемане, прилагане, актуализиране и отмяна "

Относно стандарта

1 РАЗРАБОТЕН от дружество с ограничена отговорност Lumex Marketing (Lumex Marketing LLC)

2 ВЪВЕДЕНО от Федералната агенция за техническо регулиране и метрология (TC 335)

3 ПРИЕТ от Междудържавния съвет по стандартизация, метрология и сертификация (Протокол от 14.11.2013 г. № 44-2013)

4 Този стандарт е в съответствие с основните разпоредби на международния стандарт ISO 15141-1:1998 Хранителни продукти - Определяне на охратоксин А в зърнени храни и зърнени продукти - Част 1: Високоефективен течен хроматографски метод със силикагел за почистване на зърнени продукти - Част 1: Високо ниво метод на ефективна течна хроматография с пречистване със силикагел).

Степен на съответствие - нееквивалентна (NEQ)

5 Със заповед на Федералната агенция за техническо регулиране и метрология от 30 декември 2013 г. N2 2429-st междудържавният стандарт GOST 32587-2013 е въведен в сила като национален стандарт на Руската федерация от 1 юли 2015 г.

6 ПРЕДСТАВЕНО ЗА ПЪРВИ ПЪТ

7 РЕВИЗИЯ. март 2016 г

Информацията за промените в този стандарт се публикува в годишния информационен индекс "Национални стандарти", а текстът на промените и допълненията - в месечния информационен индекс "Национални стандарти". В случай на преразглеждане (замяна) или отмяна на този стандарт, съответното съобщение ще бъде публикувано в месечния информационен индекс "Национални стандарти". Съответна информация, уведомления и текстове се публикуват и в публичната информационна система - на официалния уебсайт на Федералната агенция за техническо регулиране и метрология в Интернет.

© Стандартинформ, 2016

В Руската федерация този стандарт не може да бъде изцяло или частично възпроизвеждан, тиражиран и разпространяван като официална публикация без разрешението на Федералната агенция за техническо регулиране и метрология.

ЗАБЕЛЕЖКА: Отчетените обеми на елуиране трябва да се променят в съответствие със стойностите, получени от определянето на коефициента на предаване на охратоксин А (вижте 5.3.10).

5.4.4 Извършване на хроматографски измервания

Запишете най-малко две хроматограми на концентрата на тестовата проба, получен съгласно 5.4.3 при същите условия, при които системата е била калибрирана. Идентифицирането на охратоксин А се извършва чрез съпоставяне на времето на задържане на охратоксин А в екстракта от пробата с неговото време на задържане, получено чрез наблюдение на стабилността на калибрационната характеристика, като ширината на прозореца за идентификация е зададена на 5%.

Пример за хроматограма е показан на фигура A.1 (допълнение A).

При наличие на пик на хроматограмата на концентрата на пробата, идентифициран като пик на охратоксин А, се прави заключение за наличието на охратоксин А в пробата, определя се съдържанието му за всяка регистрирана хроматограма и несъответствието между получените стойности се проверяват по формула (2).

Ако условието на формула (2) е изпълнено, тогава средноаритметичната стойност на получените концентрации се приема като резултат от измерванията на масовата концентрация на охратоксин А в концентрата на пробата за изпитване. Ако условието на формула (2) не е изпълнено, тогава се откриват и елиминират причините за нестабилността, след което въвеждането на концентрата на пробата се повтаря.

Ако е необходимо да се потвърди правилната идентификация на пика на охратоксин А, се препоръчва да се добави разтворът на охратоксин А в подвижната фаза към концентрата на пробата. Надеждността на идентификацията може да се съди по увеличаването на височината на очаквания пик на охратоксин А. Количеството на добавения разтвор на охратоксин А се определя въз основа на факта, че масовата част на охратоксин А в пробата трябва да се увеличи с 50% - 150% спрямо първоначалната стойност.

Ако масовата концентрация на охратоксин А в крайния концентрат C x надвишава 100 ng/cm 3 , тогава той се разрежда с подвижната фаза (виж 5.3.2.1). Факторът на разреждане Q се изчислява по формулата

(8)

където Vp е обемът на разредения концентрат на пробата за изпитване, cm3;

V a е обемът на аликвотна част от оригиналния концентрат на тестовата проба, взета за разреждане,

5.5 Обработка на резултатите от изпитването

Масовата част на охратоксин А в проба X, ppm 1, се изчислява по формулата

X= V 1- V 2" C X .Q.10\ (9)

където Vi е обемът на хлороформа, взет за екстракция, cm 3 (30 cm 3);

V 2 - обемът на крайния концентрат на пробата, cm 3 (0,5 cm 3);

Cx е масовата концентрация на охратоксин А в крайния концентрат на пробата (виж 5.4.4), ng/cm 3 ; V 3 - обемът на екстракта от хлороформ, взет за изпитване съгласно 5.4.3, cm 3 (20 cm 3);

/l - тегло на пробата, g;

P е коефициентът на предаване на охратоксин А (виж 5.3.10);

Q е факторът на разреждане на концентрата на пробата (виж 5.4.4);

5.6 Метрологични характеристики

Методът осигурява резултати от измерване с метрологични характеристики, които не надвишават стойностите, дадени в таблица 2.

Несъответствието между два резултата от измерване (X| и X 2, ppm 1), получени в една и съща лаборатория при условия на повторяемост, трябва да съответства на условието

\X 1 -X 2 \<г, (10)

където r е границата на повторяемост, милиони" 1 (таблица 2).

Когато условие (10) е изпълнено, средноаритметичното от получените резултати от измерването (Xj и X 2, милион "1) се приема като резултат от измерването.

Несъответствието между два резултата от измерване, получени в две лаборатории (Xi na 6 и X 2la b, ppm 1) върху идентични проби, трябва да съответства на условието

където R е границата на възпроизводимост, ppm 1 (таблица 2).

5.7 Контрол на качеството на резултатите от измерванията

Контролът на показателите за качество на резултатите от измерванията в лабораторията осигурява наблюдение на стабилността на резултатите от измерванията, като се вземат предвид изискванията на GOST ISO 5725-6 (раздел 6).

аз

5.8 Представяне на резултатите от изпитването

Резултатите от изпитването се записват в протокол от изпитване, който е изготвен в съответствие с изискванията на GOST ISO / IEC 17025, докато протоколът от изпитването трябва да съдържа препратка към този стандарт.

Резултатите от измерванията на съдържанието на охратоксин А (с лабораторно потвърдено съответствие на аналитичната процедура с изискванията на този стандарт) са представени във формата

X ± D, милион "1 или X ± U, милион" 1, (12)

където X е резултатът от измерването, получен в съответствие с 5.6, ppm 1 ;

А - границите на абсолютната грешка при измерване на съдържанието на охратоксин А (Р = 0,95) съгласно

таблица 2, милион" 1;

U е разширената несигурност с коефициент на покритие k = 2, милиона" 1 .

Числената стойност на границите на абсолютната грешка (несигурност) се изразява като число, съдържащо не повече от две значещи цифри, докато най-малката цифра от числената стойност на крайния резултат от измерването се приема за същата като най-малката цифра от числовата стойност на границите на абсолютната грешка (несигурност).

6 Метод Б

6.1 Същност на метода

Методът се основава на екстракцията на охратоксин А с толуен след подкисляване на тестовата проба със солна киселина и добавяне на магнезиев хлорид за увеличаване на йонната сила. Екстрактът се пречиства, като се използват колони за екстракция на твърда фаза, напълнени със силикагел, и съдържанието на охратоксин А се определя чрез HPLC на колона с обърната фаза, като се използва флуориметрично откриване. Ако е необходимо, потвърдете идентифицирането на охратоксин А чрез дериватизация с разтвор на борен трифлуорид в метанол.

6.2 Реактиви

При извършване на тестове използвайте вода съгласно 5.2.13, реактиви съгласно 5.2.14 - 5.2.17, както и следното.

6.2.7 Смесен разтворител № 1: толуен (6.2.3) и ледена оцетна киселина (5.2.15) в обемно съотношение 99:1.

6.2.8 Смесен разтворител № 2: ацетон (6.2.5) и толуен (6.2.3) в обемно съотношение 5:95.

6.2.9 Смесен разтворител № 3: толуен (6.2.3) и ледена оцетна киселина (5.2.15) в обемно съотношение 90:10.

6.2.10 Подвижна фаза

Смесват се 99 обемни части ацетонитрил (5.2.16) с 99 обемни части вода (5.2.13) и две обемни части ледена оцетна киселина (5.2.15). Подвижната фаза се дегазира преди употреба.

6.2.11 Борен трифлуорид, масова част от основното вещество, не по-малко от

6.2.12 Разтвор на борен трифлуорид в метанол, p (BF 3) = 14 g/100 cm 3 .

ВНИМАНИЕ! Необходимо е да се работи в добре работещ аспиратор. Да се ​​избягва контакт с кожата, очите и дихателните органи.

6.2.13 Охратоксин А в кристална форма или под формата на ампулен препарат под формата на филм с масова част на основното вещество най-малко 95%

6.2.14 Основен разтвор на охратоксин А

Разтворете 1 mg кристален охратоксин А (6.2.13) или съдържанието на филмовата ампула, съдържаща охратоксин А, в такъв обем от смесен разтворител № 1 (6.2.7), за да получите разтвор от 20 до 30 µg охратоксин А, по маса./cm 3 .

За да определите точната масова концентрация на охратоксин А в основния разтвор, запишете оптичната му плътност в диапазона на дължината на вълната от 300 до 370 nm на стъпки от 5 nm в кварцова кювета с дебелина на оптичния слой 1 cm съгласно 6.3.2, като използвате спектрофотометър (вижте 6.3.1). Като референтен разтвор се използва смесен разтворител № 1 съгласно 6.2.7. Точната позиция на максимума на абсорбция се идентифицира чрез записване на оптичната плътност близо до него на стъпки от 1 nm. Изчислява се стойността на масовата концентрация на охратоксин А, C ref, µg/cm 3 , по формулата

където A max е оптичната плътност при максимума на абсорбцията (в този случай при 333 nm);

M е моларната маса на охратоксин А, g/mol (M=403,8 g/mol);

100 - коефициент на съответствие между единиците дължина и маса; e - моларен коефициент на абсорбция на охратоксин А в смесен разтворител № 1, m 2 / mol, (e = 544 m 2 / mol);

/ е дебелината на абсорбиращия слой на кюветата, вижте

6.2.15 Охратоксин А, 1 µg/cm3 междинен разтвор Изпарете до сухо в поток от азот една аликвотна част от изходния разтвор (6.2.14), съдържащ 100 µg охратоксин А, и разтворете в 100 ml от подвижната фаза (6.2.10). ). Обемът на аликвотната част се изчислява по формулата:

\/ a - аликвотен обем, cm3;

100 - маса на охратоксин А, mcg;

Cie* - масова концентрация на изходния разтвор на охратоксин А съгласно 6.2.14, µg/cm 3 .

Срокът на годност на разтвора в хладилник при температура от 2°С до 6°С и редовно проследяване на стабилността му е не повече от 6 месеца.

6.2.16 Разтвори за калибриране на охратоксин А

В мерителни колби с вместимост 100 cm 3 поставете 1; 2,5; 4 и 5 ml междинен разтвор на охратоксин А (6.2.15) и се разрежда до марката с подвижна фаза (6.2.10). Масовата концентрация на охратоксин А в приготвените калибровъчни разтвори е 10; 25; 40 и 50 ng/cm 3 съответно, което съответства на масата на охратоксин А 0,2; 0,5; 0,8 и 1,0 ng в дозиращ обем 20

6.3 Измервателни уреди, спомагателно оборудване, материали и посуда

При извършване на изпитвания се използват средства за измерване, спомагателно оборудване, материали и прибори съгласно 5.2.1 - 5.2.2, 5.2.6 - 5.2.11, 5.2.21 -5.2.34, както и следното.

6.3.1 Спектрофотометър, подходящ за измервания в обхвата на дължината на вълната от 300 до 370 nm и имащ спектрална широчина на честотната лента не повече от 2 nm.

6.3.2 Кварцови кювети с дебелина на абсорбиращия слой 1 cm, непоглъщащи светлина в диапазона на дължината на вълната от 300 до 370 nm.

6.3.3 Центрофужни епруветки, например, с капацитет 250 ml, изработени от полиетилен с висока плътност с капачки на винт.

6.3.4 Охладена центрофуга, за предпочитане охладена, за центрофужни епруветки (вижте 6.3.3), способна да генерира ускорение от поне 3500 in.

ЗАБЕЛЕЖКА Скоростта на центрофугата за постигане на определеното ускорение се избира според препоръките на производителя на центрофугата.

6.3.5 SPE колона, за еднократна употреба, пълна със силикагел.

След отваряне на опаковката, колоната се кондиционира за два часа при 105°C и се съхранява върху активиран силикагел с индикатор за влага. Прекарайте 10 ml толуен през колоната преди употреба (вижте 6.2.3). С всяка нова партида колони се проверява добивът на охратоксин А. Подходящи са например колони, направени от 3 cm3 полипропиленова тръба със следните характеристики:

Средната маса на силикагел е 690 mg;

Размер на порите - 12,5 nm;

Размер на частиците - от 55 до 105 микрона.

6.3.6 Резервоари за разтворители, като спринцовки, например 50 ml, с централен отвор и запушалка.

6.3.7 Разделителна фуния с капацитет 50 cm 3 съгласно GOST 25336.

6.3.8 Мембранни филтри за водни разтвори, изработени от политетрафлуоретилен, с размер на порите 0,45 µm.

6.3.9 Флакони със завита или винтова капачка.

6.3.10 Микроспирти, 500 mm 3 .

6.3.11 HPLC апарат

6.3.11.1 Течен хроматограф съгласно 5.2.1.

Дължина ................................................. ..250 mm;

Вътрешен диаметър.....................................4mm;

Размерът на сферичните частици ........................ 5 µm.

6.3.11.2 Аналитична хроматографска колона, пълна със сорбент с обърната фаза с размер на зърното 5 µm, осигуряваща разделяне на пика на охратоксин А и останалите пикове до базова линия 1 със следните характеристики:

Забележка - Разрешено е използването на аналитични колони с други стандартни размери (например дължина от 120 до 150 mm).

6.3.11.3 Предпазна колона със същия вътрешен диаметър и запълнена със същия реверс

фазов сорбент, който е същият като аналитичната колона с дължина

6.3.11.4 Предпазна колона със същия вътрешен диаметър и напълнена със същия сорбент с обърната фаза като аналитичната колона, например със следните характеристики:

Дължина ................................................. ...40 mm;

Вътрешен диаметър.....................................4 mm;

Размерът на сферичните частици ........................ 5 µm.

Забележка - Разрешено е използването на предколони с други стандартни размери.

Допуска се използването на други средства за измерване с метрологични характеристики и спомагателно оборудване с не по-лоши технически характеристики, както и материали и реактиви с качество не по-ниско от горното.

6.4 Тестване

6.4.1 Общи положения

Тестовете трябва да бъдат изпълнени в рамките на един работен ден.

6.4.2 Екстракция на охратоксин А от пробата

Поставете (20,0 ± 0,1) g от пробата, приготвена в съответствие с раздел 3, в центрофужната епруветка (6.3.3). Ако се очаква съдържание на охратоксин над 0,005 ppm, теглото на пробата се намалява до 10 g; в противен случай трябва да се вземе предвид възможният риск от намалено възстановяване на охратоксин А от пробата.

Добавете последователно 30 ml разтвор на солна киселина (вижте 6.2.1), 50 ml разтвор на магнезиев хлорид (вижте 6.2.2), разбъркайте със стъклена пръчка и добавете 100 ml толуен

Разбъркайте в продължение на 60 минути и след това центрофугирайте суспензията. Времето за центрофугиране зависи от ефективността на центрофугата. Центрофугирането се извършва при охлаждане, за да се предотврати загубата на толуен. Отстранете аликвотна част от 50 ml от горния (толуен) слой (в 2) и я прекарайте през SPE колоната, приготвена в 6.3.5 със свързан към нея резервоар (вижте 6.3.6).

ЗАБЕЛЕЖКА Трябва да се вземат мерки за избягване на претоварване на дозатора.

Колоната се промива с две порции от 10 ml хексан (5.2.17) и след това с две порции смесен разтворител № 2 (6.2.8). След това се промива с 5 cm 3 толуен, като се изхвърлят всички елуати.

Охратоксин А се елуира с две порции от по 15 ml смесен разтворител № 3 (6.2.9) в колба със заострено дъно от 50 ml (5.2.25). Комбинираният елуат внимателно се изпарява до сух остатък при понижено налягане и при температура не по-висока от 40 °C. Остатъкът се разтваря в 1 ml (1/3) от подвижната фаза (виж 6.2.10) и се прехвърля във флакон (виж 6.3.9).

Бележки

1 Условията за елуиране на охратоксин А и последващите операции може да зависят от вида на колоните, използвани за екстракция на твърда фаза. Например, проверете дали обемът на елуента, посочен по-горе, съответства на типа на използваната колона.

2 Размерът и/или формата на колбата може да има отрицателен ефект върху добива на охратоксин А.

6.4.3 Условия за хроматографски анализ

лизирането се извършва при следните условия:

Дебит на подвижната фаза .................1 cm 3 /min;

Дължина на вълната на възбуждане на флуоресценция 330 nm;

Дължина на вълната на регистриране на флуоресценция ......... 460 nm;

Обем на дозиране ............................................20 mm 3 .

6.4.4 Калибриране на хроматографа

Ако се използват колона съгласно 6.3.11.2 и подвижна фаза съгласно 6.2.10, тогава хроматографският анализ

Калибрирането на хроматографа се извършва по време на разработването на техниката и в бъдеще във всички случаи, когато условията на хроматографския анализ се променят.

Инжектирайте в хроматографа поне четири разтвора за калибриране с различни масови концентрации на охратоксин А (вижте 6.2.16). Дозираният обем на всеки калибриращ разтвор трябва да бъде еднакъв.

Калибрационната характеристика се установява като зависимостта на площта или височината на пика от масата на охратоксин А в инжектирания обем.

Проверете линейността на установената калибрационна характеристика, като използвате коефициента на корелация (вижте 5.3.7). Всеки ден преди започване на работа стабилността на калибровъчната характеристика се проверява по същия начин, както в 5.3.8, като се използва калибровъчен разтвор на охратоксин А с масова концентрация 25 ng/cm 3 (виж 6.2.16).

6.4.5 Идентифициране на охратоксин А

Пикът на охратоксин А се идентифицира чрез сравняване на времената на задържане на пиковете в хроматограмата на пробата и калибриращите разтвори. В някои случаи може да е необходимо да се инжектира проба, допълнена с разтвор на охратоксин А в подвижната фаза (виж 5.4.4).

6.4.6 Количествено определяне

Разтворът на пробата, приготвен съгласно 6.4.2, незабавно се инжектира в хроматографа. Обемът на дозиране трябва да бъде равен на обема на дозиране на разтворите за калибриране при калибриране на хроматографа (вижте 6.4.4).

Измерете площта или височината на пика на охратоксин А върху хроматограмата на пробата и като използвате калибровъчната характеристика (вижте 6.4.4), намерете нейната маса (/n-i, ng) в инжектирания обем.

Ако стойността на реакцията на охратоксин А върху хроматограмата на пробата е извън границите на калибровъчната характеристика, тогава приготвеният разтвор на пробата се разрежда или концентрира преди да влезе в хроматографа, като този факт се взема предвид при изчисляване на резултатите от измерването съгласно до 6.5.

6.4.7 Потвърждение

Ако е необходимо, потвърдете идентифицирането на пика на охратоксин А чрез неговото изчезване и едновременното появяване на пик с време на задържане, съвпадащо с времето на задържане на пика на метилов естер на охратоксин А в резултат на дериватизация на борен стрифлуорид.

Вземете 0,5 cm 3 от разтвора, приготвен съгласно 6.4.2, в заострена колба, изпарете до сухо на ротационен изпарител (вижте 5.2.7). Сухият остатък се разтваря в 1 ml метиленхлорид (6.2.4) и се добавят 2 ml разтвор на борен трифлуорид в метанол (6.2.12).

Колбата се запушва плътно и се нагрява на водна баня при 50°C до 60°C в продължение на 15 min. След охлаждане разтворът се прехвърля в делителна фуния с вместимост 50 cm 3, съдържаща 30 cm 3 вода, разклатена на 30°С с три порции метиленхлорид, по 10 cm 3 всяка. Комбинирайте органичните фази след всяка екстракция в друга 50 cm 3 разделителна фуния, добавете 20 cm 3 вода за промиване и разклатете за 30 s.

Органичната фаза се филтрира през тампон от безводен натриев сулфат (5.2.14) в заострена колба, изпарява се до сухо, разтваря се в 500 mm 3 от подвижната фаза (6.2.10) и се записва хроматограмата на получения разтвор при условията от 6.4.3.

За да се установи времето на задържане на метиловия естер на охратоксин А и да се провери пълнотата на дериватизацията при горните условия, междинният разтвор се третира съгласно 6.2.15.

6.5 Обработка на резултатите от изпитването

Масовата част на охратоксин A X, милион "1 се изчислява по формулата

където Vi е обемът на толуола, взет за екстракция съгласно 6.4.2, cm3 (100 cm3);

\/ 3 - обемът на разтвора на пробата, приготвен съгласно 6.4.2, cm 3 (1 cm 3);

mi е масата на охратоксин А, определена съгласно 6.4.6, ng;

V 2 - обемът на аликвотна част от центрофугата съгласно 6.4.2, cm 3 (50 cm 3);

V 4 - обемът на дозиране на приготвения разтвор на пробата, cm 3;

/77 - маса на взетата проба за изследване, g;

10" 3 - коефициентът на съгласуване на размерите на единиците маса.

6.6 Метрологични характеристики

6.6.1 Резултатите от междулабораторния тест за определяне на точността на метода, извършен в съответствие с GOST ISO 5725-2, са дадени в допълнение Б. Стойностите, получени от междулабораторния тест, може да не са приложими в диапазоните на концентрациите на охратоксин А и за матрици, различни от посочените в допълнение Б.

6.6.2 Абсолютното несъответствие между два единични резултата от изпитване, получени при условия на повторяемост, може да надхвърли границата на повторяемост r в не повече от 5% от случаите.

Стойности на границите на повторяемост r при анализа на пшенично брашно от цели зърна:

/=0,18 µg/kg (0,00018 ppm 1) при X=0,41 µg/kg (0,00041 ppm 1);

/=0,70 µg/kg (0,00070 ppm 1) при Х=1,23 µg/kg (0,00123 ppm 1).

6.6.3 Абсолютното несъответствие между два единични резултата от теста, получени при условия на възпроизводимост, може да надхвърли границата на възпроизводимост R в не повече от 5% от случаите.

Стойностите на границите на възпроизводимост R при анализ на пшенично брашно от цели зърна: R=0,30 µg/kg (0,00030 ppm 1) при X=0,41 µg/kg (0,00041 ppm 1);

R=1,10 µg/kg (0,00110 ppm 1) с X=1,23 µg/kg (0,00123 ppm 1).

6.7 Контрол на качеството на резултатите от измерванията - съгласно 5.7.

6.8 Регистриране на резултатите от изпитването - съгласно 5.8.

Приложение А (информативно)

Пример за хроматограма

A.1 Фигура A.1 показва примерна хроматограма (метод A) на R-Biopharm Rhone Ltd. OW-815 "Охратоксин А в смляна пшеница" стандартен концентрат. с масова част на охратоксин А (0,0049 + 0,0010) милиона "1.

4 6 8 10 12 14 16 Време, мин

Фигура A.1 - Пример за хроматограма 2 3

Приложение Б (информативно)

Прецизни данни

B.1 Данните, дадени в таблица B.1, са получени в резултат на междулабораторни тестове, проведени за метод B в съответствие с GOST ISO 5725-2 от института Макс фон Петенкофер (Берлин, Германия) върху проби от пшенично брашно.

Таблица B.1 - Данни за точността на метода

Име Пшенично брашно Пшенично брашно индикатор Брой лаборатории Брой проби Брой лаборатории, оставащи след елиминиране на отклоненията Брой емисии Брой приети резултати Средна X стойност, µg/kg Стандартно отклонение на повторяемостта s r, µg/kg Относително стандартно отклонение на повторяемостта RSD r Граница на повторяемост g, µg/kg Стандартно отклонение на възпроизводимост s R , µg/kg Относително стандартно отклонение на възпроизводимост RSD r Граница на възпроизводимост R, µg/kg

UDC 543.544.5.068.7:006.354 MKS 67.060 NEQ

Ключови думи: зърно, хранително зърно, фуражно зърно, храна за животни, продукти от преработка на зърно, методи за изпитване, хроматография, високоефективна течна хроматография, охратоксин А, микотоксини

Подписано за печат на 14.04.2016 г. Формат 60x84V 8 .

Уел. фурна л. 2.33. Тираж 22 бр. Зак 1070.

Изготвен на базата на електронната версия, предоставена от разработчика на стандарта

ФГУП "СТАНДАРТИНФОРМ"

123995 Москва, Гранатни пер., 4. www.gostinfo.ru [имейл защитен]

СТАНДАРТНО ЗЪРНО И ПРОДУКТИ ОТ НЕГОВАТА ПРЕРАБОТКА, СМЕСЕН ФУРАЖ Определяне на охратоксин А чрез високоефективна течна хроматография

МЕЖДУДЪРЖАВЕН

Зърно и продукти от неговата преработка, смесени фуражи.

Определяне на охратоксин А чрез високоефективна течна хроматография

Дата на въвеждане - 01.07.2015 г

1 област на използване

Този стандарт се прилага за зърно и продукти от неговата преработка и установява методи за определяне на съдържанието на охратоксин А с помощта на високоефективна течна хроматография (наричана по-долу HPLC) с флуориметрично откриване, използвайки:

Скрининг на проби и пречистване чрез колонна хроматография (метод А) в хранителни зърна, брашна и зърнени продукти на основата на пшеница, царевица, ечемик, ръж, овес и ориз, фуражи и суровини за производството им на зърнена основа (кюспе, шрот) в диапазона на измерване масова фракция на охратоксин А от 0,0025 до 1,0 милиона "1;

Пречистване чрез твърдофазова екстракция (метод Б) в житни зърна и брашно в диапазон на измерване на масовата фракция на охратоксин А над 0,0004 милиона "1.

Забележка -1 ppm 1 съответства на 1 mg/kg или 1000 µg/kg.

2 Нормативни справки

Този стандарт използва нормативни препратки към следните стандарти:

От обединената проба се изолира лабораторна проба с тегло най-малко 100 g, която се смила до такова състояние, че да премине през сито с диаметър на отворите 1 mm. Изолираната смляна лабораторна проба се разбърква старателно и се съхранява до изследването на сухо и тъмно място в съд под капак.

Пробите от брашно се изследват без смилане.

4 Изисквания за безопасност

При извършване на измерванията трябва да се спазват следните изисквания:

Електрическа безопасност в съответствие с GOST 12.1.019 и техническа документация за хроматографа;

Безопасност при експлозия в съответствие с GOST 12.1.010;

Пожарна безопасност в съответствие с GOST 12.1.004;

Безопасност при работа с вредни вещества в съответствие с GOST 12.1.007.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Охратоксин А причинява увреждане на бъбреците и черния дроб и се предполага, че е канцероген. Цялата работа, свързана с подготовката на пробите и подготовката на разтвори на охратоксин А, трябва да се извършва в аспиратор, като се използват защитно облекло, ръкавици и очила. Обеззаразяването на стъклария, която е била в контакт с охратоксин А, се извършва с 4% разтвор на натриев хипохлорит.

5 Метод А

5.1 Същност на метода

Методът се основава на екстракцията на охратоксин А от анализираната проба на продукта с подкислен хлороформ, скрининг на проби, които могат да съдържат охратоксин А, пречистване на техните екстракти чрез колонна хроматография върху силикагел и определяне на масовата част на охратоксин А с помощта на HPLC с флуориметрично откриване.

5.2 Измервателни уреди, спомагателно оборудване, референтни материали, реактиви, стъклария и материали

5.2.1 Течен хроматограф с флуориметричен или спектрофлуориметричен детектор, осигуряващ възбуждане на флуоресценция в спектралната област (330 + 20) nm и регистрация

интензитет на флуоресценция в спектралната област (465 ± 20) nm. Използваният детектор трябва да гарантира, че границата на откриване на охратоксин А е не повече от 5 ng/cm 4 5

5.2.2 Неавтоматични везни в съответствие с GOST OIML R 76-1-2011 с граници на допустимата абсолютна грешка не повече от ± 0,01 g.

5.2.3 Аналитична хроматографска колона, пълна със сорбент с обратна фаза с размер на зърното 5 µm, имаща ефективност от най-малко 5000 теоретични плаки за пика на охратоксин А*.

5.2.4 Предпазна колона със същия вътрешен диаметър и напълнена със същия обратнофазов сорбент като аналитичната колона.

5.2.5 Хроматографска стъклена колона с шлифована запушалка, 200 mm дължина и 10 mm вътрешен диаметър.

5.2.6 Мелница за проби, способна да смила до частици, по-малки от 1 mm, като например лабораторна мелница.

5.2.7 Ротационен изпарител тип IR-1 M2 или подобен, оборудван с водна баня с регулатор на температурата в диапазона от 20 °C до 50 °C.

5.2.8 Устройство за смесване на проби (шейкър), осигуряващо честота на разклащане до 120 min" 1 .

5.2.9 Лабораторна вакуумна, диафрагмена или водоструйна помпа съгласно GOST 25336, осигуряваща вакуум от 2,5 до 10 kPa.

5.2.10 Сушилен шкаф, осигуряващ температура до 200 °С.

5.2.12 Стандартна проба от състава на разтвор на охратоксин А в ацетонитрил с масова концентрация 50 µg/cm 5 с допустимо отклонение ± 2,5 µg/cm 5 . Приложимо

стандартни проби от състава на разтвор на охратоксин А в други разтворители, които трябва да се вземат предвид при приготвянето на първоначалния разтвор съгласно 5.3.3.1.

5.2.13 Дестилирана вода съгласно GOST 6709 или вода за лабораторен анализ с чистота 1 съгласно GOST ISO 3696.

5.2.22 Градуирани пипети от типове 1-3, версии 1 (1 а) или 2 (2а), 2-ри клас на точност, с капацитет 1,2, 5 cm 5 съгласно GOST 29227.

5.2.23 Размерни цилиндри, версии 1-4 от 2-ри клас на точност, с капацитет 25, 50, 250 cm 5 съгласно GOST 1770.

5.2.24 Мерителни колби 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 съгласно GOST 1770.

5.2.25 Колби със заострено дъно 0-10-14/23 и 0-50-14/23 съгласно GOST 25336.

5.2.26 Колби с плоско дъно тип P-1 или Kn-1 с вместимост 50, 100, 250 cm 5 съгласно GOST 25336.

5.2.27 Едноканални пипети с променлив обем от 100 до 1000 mm 5 с метрологични характеристики в съответствие с GOST 28311.

5.2.28 Лабораторни фунии тип B в съответствие с GOST 25336.

5.2.30 Епруветка за микропроби за еднократна употреба (тип Eppendorf)

5.2.31 Стъклени съдове с вместимост 50, 250, 1000 cm 5 със запушалки от шлифовано стъкло, флуоропласт или полиетилен.

5.2.32 Сито с диаметър на отвора 1,0 mm.

5.2.33 Стъклени пръчки.

5.2.34 Пясъчен часовник или таймер.

5.2.35 Хартиени филтри "бюрокрация".

5.2.37 Силикагел за колонна хроматография, размер на частиците 100 до 200 µm. Разрешено е използването на други средства за измерване с метрологични характеристики, които не са

по-лоши от горните и спомагателни съоръжения и материали с технически характеристики не по-лоши от горните.

5.3 Подготовка за тестване

5.3.1 Подготовка на стъклария

Съдовете за приготвяне и съхранение на подвижната фаза се измиват само със сярна киселина съгласно 5.2.20 (без използване на други детергенти), измиват се обилно с чешмяна вода и се изплакват с дестилирана вода.

Останалите стъклени съдове се измиват с гореща вода и препарат, изплакват се обилно с дестилирана вода и се сушат в сушилня при температура 105 °C.

5.3.2 Приготвяне на спомагателни разтвори

5.3.2.1 Подготовка на подвижната фаза

В мерителна колба с вместимост 500 cm 3 с плътно затворена стъклена, флуоропластична или полиетиленова запушалка се поставят 5 cm 3 ледена оцетна киселина (виж 5.2.15), 215 cm 3 ацетонитрил (виж 5.2.16) и разредете до марката с дестилирана вода. Сместа се разбърква старателно. Не се допуска контакт на подвижната фаза с гума.

Срок на годност на сместа при стайна температура - не повече от 1 месец.

5.3.2.2 Приготвяне на 1% разтвор на оцетна киселина

Поставят се 200 ml дестилирана вода и 2 ml ледена оцетна киселина (5.2.15) в плоскодънна колба от 250 ml и се разбъркват добре.

Срокът на годност на разтвора при стайна температура в стъклен съд с плътно затворена стъклена, флуоропластична или полиетиленова запушалка е не повече от 1 месец.

5.3.2.3 Приготвяне на смес от хлороформ и мравчена киселина в обемно съотношение

Поставят се 200 ml хлороформ (5.2.18) и 4 ml мравчена киселина (5.2.19) в плоскодънна колба от 250 ml. Добавят се 10 g безводен натриев сулфат (5.2.14). Сместа се разбърква добре, филтрира се през филтър "червена лента".

Срокът на годност на сместа при стайна температура в стъклен съд с шлифована стъклена, флуоропластична или полиетиленова запушалка е не повече от 1 месец.

5.3.3 Приготвяне на разтвори на охратоксин А

5.3.3.1 Приготвяне на изходен разтвор на охратоксин А с масова концентрация 1

Пипетирайте 1 cm 3 от стандартна проба от състава на разтвор на охратоксин А в ацетонитрил с масова концентрация 50 µg/cm 3 (вижте 5.2.12), поставете я в мерителна колба с вместимост 50 cm 3 и довежда се обемът до марката с ацетонитрил (виж 5.2.16).

Срокът на годност на приготвения разтвор в хладилник при температура от 2°C до 6°C - не повече от 6 месеца.

Когато се използва стандартна проба от състава на разтвор на охратоксин А в други разтворители, аликвотна част (1 cm 3) се изпарява до сух остатък във вакуум при температура на водна баня от 40 °C до 45 °C или в поток на азот. Сухият остатък се разтваря в 2 cm 3 ацетонитрил и се разбърква в продължение на 1 min. След това полученият разтвор се прехвърля количествено в мерителна колба с вместимост 50 cm 3 и се разрежда до марката с ацетонитрил.

Забележка - Позволено е изходният разтвор на охратоксин А да се приготвя съгласно 6.2.14-6.2.15, като се използва ацетонитрил вместо подвижната фаза съгласно 6.2.10.

5.3.3.2 Приготвяне на разтвор на охратоксин А в ацетонитрил с масова концентрация 100

В мерителна колба с вместимост 50 cm 3 се поставят 5 cm 3 разтвор на охратоксин А с масова концентрация 1 μg/cm 3 съгласно 5.3.3.1, което съответства на 1000 ng/cm 3, и се довежда до обем до маркировката с подвижната фаза съгласно 5.3.2.1.

Срок на годност на получения разтвор в хладилник при температура от 2°C до 6°C - не повече от 3 месеца.

5.3.3.3 Приготвяне на разтвори за калибриране на охратоксин А

Първоначалният разтвор на охратоксин А в ацетонитрил съгласно 5.3.3.1 се поставя в мерителна колба с вместимост 50 cm 3 . Обемът на разтвора на охратоксин А трябва да отговаря на изискванията на таблица 1.

маса 1

решение	Обемът на първоначалния разтвор съгласно 5.3.3.1, cm3	Номинална стойност на масовата концентрация, ng / cm3

Съдържанието на колбата се разрежда до марката с подвижната фаза съгласно 5.3.2.1 в съответствие с таблица 1.

Срок на годност на разтворите за калибриране - не повече от седем дни.

Забележка - Ако е необходимо, е разрешено да се приготвят разтвори на охратоксин А с други концентрации по подобен начин в диапазона на линейност на калибровъчната характеристика (виж 5.3.7).

5.3.3.4 Всички разтвори на охратоксин А се съхраняват в хладилник при температура не по-висока от 6 °C или във фризер при температура не по-висока от минус 18 °C в стъклени или флуоропластични съдове.

Действителната стойност на масовата концентрация на охратоксин А в разтвори съгласно 5.3.3.1 - 5.3.3.3 се изчислява въз основа на стойностите на масовата концентрация на охратоксин А съгласно стандартния сертификат за проба.

Преди употреба разтворите се съхраняват до достигане на стайна температура.

5.3.4 Подготовка на стъклената хроматографска колона

Стъклената хроматографска колона се приготвя непосредствено преди теста.

Поставете (1,0 ± 0,1) g силикагел (5.2.37) в 50 ml бехерова чаша, добавете 10 до 15 ml хлороформ (5.2.18) и разбъркайте добре. Получената суспензия се държи в бехерова чаша за 4-5 минути и след това на няколко етапа суспензията от силикагел се прехвърля в колоната през фуния с диаметър 25 или 36 mm, след като върху нея се постави парче памук. отдолу.

След като силикагелът се утаи в колоната, върху нея се поставя слой от около 2 g безводен натриев сулфат (виж 5.2.14).

В процеса на работа с колоната не трябва да се допуска изсъхване на сорбента, за което е необходимо да се поддържа слой разтворител над десиканта. Когато е готова, колоната трябва да се напълни с хлороформ над нивото на сорбента, да се затвори с шлифована запушалка и изходът на колоната да се потопи в хлороформ.

Подготвената колона се използва еднократно.

5.3.5 Подготовка на хроматографа

Подготовката на хроматографа за измерване се извършва в съответствие с ръководството (инструкцията) за работа.

Задайте работните дължини на вълната за възбуждане и откриване на флуоресценция (вижте 5.2.1). Скоростта на подаване на подвижната фаза се задава в зависимост от размера на колоната, като се ръководи от инструкциите на производителя на хроматографа и колоната. Например, за колоната, посочена в 5.2.3, препоръчителната обемна скорост на подвижната фаза е 200 mm 3 /min. Ако има колонен термостат, температурата се настройва на (25 ± 1) °C.

5.3.6 Условия за хроматографски анализ

Ако се използват хроматографска колона съгласно 5.2.3 и подвижна фаза съгласно 6.2.10, тогава хроматографският анализ се извършва при следните условия:

Дължина на вълната на възбуждане на флуоресценция ..................330 nm;

Дължина на вълната на регистриране на флуоресценция...................465 nm;

Дебит на подвижната фаза .................................200 mm 3 /min;

Обем на дозиране ................................................. .................. 20 mm 3;

Температурата на колонния термостат (ако има такъв) ... (25 ± 1) °С.

Когато се използват колони с други стандартни размери, скоростта на потока на подвижната фаза и обемът на дозиране се избират в съответствие с инструкциите на производителя на хроматографа и колоната.

5.3.7 Калибриране на хроматографа

Диапазонът на линейност на калибровъчната характеристика е от 10 до 100 ng/cm 3 . Разтворите за калибриране на охратоксин А съгласно 5.3.3.3 се използват като проби за калибриране на хроматографа.

Записват се най-малко две хроматограми от всеки разтвор за калибриране и хроматографът се калибрира чрез задаване на параметрите на калибрационната характеристика и времето на задържане на охратоксин А с помощта на софтуера за хроматографа.

Изчислете коефициента на корелация и отклонението на изчислените стойности на масовата концентрация на охратоксин А във всяка точка на калибриране от действителната стойност в съответствие с процедурата за приготвяне на разтвори за калибриране (вижте 5.3.3.3).

Дипломирането се счита за приемливо, ако:

Коефициент на корелация не по-малък от 0,998;

Относителното отклонение на изчислената стойност на масовата концентрация на охратоксин А от действителната стойност е не повече от + 10%. Вместо относително отклонение, приемливостта на калибрираща характеристика може да се оцени чрез относително стандартно отклонение, което не трябва да надвишава 5%.

5.3.8 Проверка на стабилността на калибровъчната характеристика

Контролът на стабилността на калибровъчните характеристики се извършва ежедневно преди стартиране

Като контролен разтвор използвайте разтвор на охратоксин А в подвижната фаза, приготвен по същия начин, както в 5.3.3.3. Масовата концентрация на охратоксин А в контролната проба се избира въз основа на очакваното съдържание на охратоксин А в тестовите проби; препоръчва се използването на разтвор на охратоксин А с масова концентрация 20 ng/cm.

Запишете най-малко две хроматограми на контролния разтвор и идентифицирайте пика на охратоксин А чрез време на задържане с ширина на идентификационния прозорец от 5%, като направите, ако е необходимо, софтуерна корекция на времето на задържане на пика и като използвате характеристиката на калибриране, изчислете масата концентрация на охратоксин А за всеки вход.

Сближаването на стойностите на времето на задържане и стойностите на масовата концентрация на охратоксин А се проверява по формулите:

където U и t 2 - времето на задържане на пика на охратоксин А съответно в първата и втората хроматограма, min;

I - средноаритметична стойност на U и t 2 , min.

Sk: и С«2 - масови концентрации на охратоксин А в контролния разтвор съответно на първата и втората хроматограма, ng/cm3;

C до - средноаритметичната стойност на стойностите C K: и C u, ng / cm 3.

Зависимостта на калибриране се признава за стабилна, ако условието

където С е масовата концентрация на охратоксин А в контролния разтвор, ng/cm.

Ако условие (3) не е изпълнено, тогава контролната процедура се повтаря. Резултатите от повторния контрол се считат за окончателни и калибрирането на хроматографа съгласно 5.3.7 се извършва отново.

Забележка - Повторно калибриране на хроматографа обикновено се изисква, когато ефективността на хроматографската система или чувствителността на детектора се промени (например след ремонт или дълъг престой на хроматографа).

5.3.9 Проверка на реактивна заготовка

Реактивен празен тест се провежда преди тестване на тестовите проби.

30 cm 3 хлороформ и 2,5 cm 3 разтвор на оцетна киселина съгласно 5.3.2.2 се поставят в плоскодънна колба с вместимост 50 cm 3, смесват се старателно и внимателно се вземат от долния слой от 20 cm 3 хлороформ в колба с остро дъно за изпаряване с капацитет 50 cm 3, като се избягва попадането на вода в нея.

Заострената колба се поставя върху ротационен изпарител и се изпарява във вакуум до сухо при температура на водна баня от 40°С до 45°С. Продължете с всички стъпки от 5.4.3, като по този начин получите празен концентрат. Провежда се хроматографско изследване на получения концентрат съгласно 5.4.4. Ако хроматограмата съдържа пикове, които са близки по време на задържане до пика на охратоксин А, тогава причините за замърсяване на празната проба (реактиви или стъклария) се откриват и елиминират.

ЗАБЕЛЕЖКА: Най-честата причина за лоши резултати от празната контрола е недостатъчната чистота на хлороформа, който може да бъде замърсен с примеси, които имат времена на задържане, близки до охратоксин А. Такъв хлороформ трябва да бъде заменен или подложен на цялостна дестилация, като се събира средната фракция с точка на кипене от 60 ° C до 62 ° C.

5.3.10 Отчитане на загубата на охратоксин А по време на подготовката на пробата

30 cm 3 хлороформ (виж 5.2.18) и 2,5 cm 3 разтвор на оцетна киселина (виж 5.3.2.2) се поставят в плоскодънна колба с вместимост 50 cm 3, 0,25 cm 3 разтвор на охратоксин А в ацетонитрил, масова концентрация 100 ng/cm3 (виж 5.3.3.2). Разбъркайте старателно и внимателно отстранете 20 cm 3 от хлороформния (долния) слой в 50 cm 3 заострена изпарителна колба, като избягвате навлизането на вода в нея. Изпарява се до сухо във вакуум при температура на водна баня от 40°С до 45°С.

Освен това всички операции съгласно 5.4.3 продължават, хроматографският анализ на получения концентрат се извършва съгласно 5.4.4 и, използвайки калибровъчната характеристика съгласно 5.3.7, се изчислява масовата концентрация на охратоксин А в концентрата. .

Тогава коефициентът на предаване на охратоксин A p се изчислява по формулата

(4)

V 0 - обемът на разтвора на охратоксин А съгласно 5.3.3.2, избран за приготвяне на контролата

проба, cm3 (0,25 cm3).

Коефициентът на предаване на охратоксин А се определя най-малко три пъти на етапа на овладяване на техниката и след това при смяна на партиди от реагенти. Получените стойности трябва да отговарят на следните изисквания:

Всяка от получените стойности е не по-малка от 0,7;

Относителната стойност на обхвата на получените стойности съответства на условието

I max Umin I q jq ^

където Dmax и t| min - най-голямата и най-малката от получените стойности на коефициента на предаване на охратоксин А;

г) - средно аритметично от получените стойности на коефициента на предаване на охратоксин

Ако и двете условия са изпълнени, тогава средноаритметичната стойност на коефициента на предаване на охратоксин А се използва при изчисляване на резултатите от определянето съгласно формула (9). В противен случай се откриват причините за загубата на охратоксин А и се повтаря определянето на коефициента на предаване.

Бележки

1 Причината за незадоволителния резултат от определянето на коефициента на пропускливост може да бъде повишена скорост на преминаване на елуента през колоната.

2 Трябва да се обърне специално внимание на необходимостта от определяне на коефициента на предаване на охратоксин А при смяна на партидата силикагел. При преминаване към нова партида силикагел се препоръчва да се оптимизират обемите на елуентите, използвани при колонното пречистване на пробите (вижте 5.4.3), като се постигне най-високата стойност на коефициента на пропускливост. Намерените в този случай обеми се използват при пречистването на проби върху колони, направени от дадена партида от реагента.

3 Препоръчва се да се изясни коефициентът на предаване на охратоксин А за специфични матрици, като се използват стандартни проби от състава на продукта със сертифицирана стойност на масовата част на охратоксин А или чрез анализ на „чиста“ проба (охратоксин А не се открива в пробата) , която е допълнена с охратоксин А. Анализирайте стандартната проба (охратоксин А) проба съгласно 5.4.1 до 5.4.4. Изчислете резултата от анализа (вижте 5.5) и намерете коефициента на предаване на охратоксин А като съотношението на получения резултат към сертифицираната стойност на масовата част на охратоксин А в стандартната проба или към масовата фракция на охратоксин А в добавката .

5.4 Тестване

5.4.1 Екстракция на охратоксин А от пробата

Проба от натрошения продукт с тегло (5,00 ± 0,01) g се поставя в плоскодънна колба с вместимост 100 cm 3 . Добавят се 30 ml хлороформ (5.2.18) и 2,5 ml разтвор на оцетна киселина (5.3.2.2) и се разбърква енергично в продължение на 30 минути. Прекарайте получения екстракт през хартиен нагънат филтър "червена лента", като изберете 20 cm 3 от филтрата за изпаряване.

Ако не е възможно да изберете 20 cm 3 от филтрата, изберете максималния възможен обем, измерете го и използвайте получената стойност във формулата (9).

Полученият филтрат се прехвърля в 50 cm3 остродънна колба и се изпарява до сухо във вакуум при температура на водна баня от 40°C до 45°C.

Сухият остатък се третира съгласно 5.4.2 или 5.4.3, в зависимост от целта на теста - скрининг на проби или количествено определяне на масовата фракция на охратоксин А в проба, в която скринингът разкрива пик, идентифициран като пик на охратоксин А.

ЗАБЕЛЕЖКА: Когато се тестват проби, за които има причина да се смята, че са замърсени с охратоксин А, е позволено да се премине директно към пречистване в колона съгласно 5.4.3, заобикаляйки скрининга.

5.4.2 Скрининг проби

Сухият остатък, получен съгласно 5.4.1, се разтваря в 0,5 cm3 от подвижната фаза съгласно 5.3.2.1 и се разбърква в продължение на 1 min. След това се добавят 3 ml хексан (виж 5.2.17) и отново се разбърква енергично. След разделяне на двете несмесващи се фази внимателно прехвърлете приблизително 0,3 cm 3 от долния слой в 1,5 cm 3 епруветка за микропроби за еднократна употреба (епруветка Eppendorf) или еквивалентна.

Запишете хроматограмата на получения разтвор съгласно 5.4.4 в деня на изпитването. Ако на хроматограмата се открие пик, който се идентифицира от софтуера за хроматографа като пик на охратоксин А, тогава тестът на пробата се повтаря, включително задължително пречистване съгласно 5.4.3.

Ако няма пик, идентифициран като пик на охратоксин А, се прави заключението, че няма охратоксин А в пробата на нивото на долната граница на обхвата на измерване (0,0025 ppm).

5.4.3 Почистване и подготовка на пробите

Сухият остатък съгласно 5.4.1 се разтваря в 1 cm3 хлороформ.

Подгответе стъклената колона съгласно 5.3.4. Оставете хлороформа да се отцеди до нивото на безводен натриев сулфат и нанесете получения разтвор в колоната. Колбата със заострено дъно, в която се изпарява екстрактът, се промива два пъти с 1 cm3 хлороформ, който също се нанася върху колоната. След това колоната се промива с 10 cm 3 хексан, елуатът се изхвърля.

След това 30 ml смес от хлороформ и мравчена киселина (виж 5.3.2.3) се пропускат през колоната със скорост не повече от една капка в секунда, като се елуира охратоксин А. Целият елуат се събира в колба с остро дъно и се изпарява до сухо във вакуум при температура на водна баня от 40 °С до 45 °С.

Сухият остатък се разтваря в 0,5 ml подвижна фаза (виж 5.3.2.1) и се разбърква в продължение на 1 min. След това се добавят 3 cm 3 хексан и отново се разбърква енергично. След разделяне на двете несмесващи се фази внимателно прехвърлете приблизително 0,3 cm 3 от долния слой в 1,5 cm 3 епруветка за микропроби за еднократна употреба (епруветка Eppendorf) или еквивалентна. Полученият концентрат се използва за хроматографски измервания съгласно 5.4.4 в деня на изпитването.

Например, колоната Lichrospher® 100 RP 18 е пример за търговски продукт, който отговаря на тези изисквания. Тази информация е дадена за удобство на потребителите на този международен стандарт и не представлява одобрение на посочения продукт.

Пикът съответства на съдържание на охратоксин А от 0,0042 ppm.

* Пример за търговски продукт, който отговаря на посочените изисквания, е хроматографска колона с вътрешен диаметър 2,1 mm и дължина 120 mm, напълнена със сорбент с обърната фаза Kromasil C-18 с размер на частиците 5 μm, оборудвана с предколона с дължина 25 мм. Тази информация е дадена за удобство на потребителите на този международен стандарт и не представлява одобрение на посочения продукт.

Гъбите - продуценти на охратоксини - са гъби от родовете Aspergillus и Penicillium. Първите доклади за токсичността за патиците на отпадъчните продукти на гъбичките A. ochraceus са направени от Скот през 1965 г. През следващите години бяха проведени голям брой изследвания за изолиране на отпадъчните продукти от тази гъба в чиста форма, за да дешифрира химическата структура на изолираните микотоксини, да изследва тяхната биологична активност, условията за образуване на токсини, методи за определяне в различни биологични субстрати. Охратоксините са кръстени на вида гъба, която е била първият производител на този микотоксин.

От култура на гъбата A. ochraceus са изолирани 4 охратоксина А, В, С и D. Най-голямо санитарно-токсикологично значение има охратоксин А. Добре се разтваря в ацетон, бензен, ацетонитрил, хлороформ и алкохоли. При взаимодействие с железен хлорид образува червен комплекс, силни комплекси с алкали.

Основните гъби, произвеждащи охратоксини, са A. ochraceus и P. veridicatum. В страните с топъл климат фуражите най-често се заразяват с охратоксин от гъбата A. ochraceus, в страните с умерен климат - от гъбата P. veridicatum. Оптималната температура на субстрата, при която се получава най-голямо токсинообразуване при култивиране, е 28 °С за гъбите A. ochraceus и 20 °С за гъбите P. veridicatum.

Според Н. В. Волков (1980), от 316 гъбични изолати, изолирани в пет свиневъдни комплекса на Украйна, 106 щама (33,5%) са причислени към гъби A. ochraceus. От това количество четири изолата образуват охратоксин А.

Гъбите - производители на охратоксин А - често се срещат във фуражите в Русия, но са регистрирани много малко случаи на заболяване при животните. Това се дължи на липсата на чувствителен и специфичен метод за определяне на охратоксин А във фуражите. Наскоро охратоксикоза А е установена в редица свинеферми в Курска и Белгородска област (GP Kononenko et al., 1999).

Охратоксините, подобно на други микотоксини, се разрушават относително бързо в тялото на животните. Въпреки това има съобщения, че в зависимост от дозата микотоксинът може да се задържи в мускулната тъкан и мускулите на свинете до 2 седмици, в черния дроб до 3 и в бъбреците до 4 седмици. Следователно е необходимо да се определи периодът на клане на животните след последния случай на поглъщане на микотоксин в тялото на 4 седмици. Възможно е също така микотоксинът да се отдели с млякото, ако попадне в тялото с храната в относително големи количества.

Охратоксин А се отнася до силно токсични съединения - LD50 за лабораторни животни с еднократно перорално приложение от 20-28 mg / kg тегло на животното, за 7-дневни пилета 11-15 mt / kg. Микотоксинът има изразена кумулация. Най-чувствителни към него са прасетата, особено младите, след това птиците.

Когато съдържанието на микотоксин във фуража е 0,2-0,4 mg / kg фураж при прасета, дори при продължително хранене, не са отбелязани клинични признаци на интоксикация, но се наблюдава намаляване на наддаването на тегло и полиурия. За пилета субтоксичната доза е 0,6-0,8 mg/kg фураж, токсичната доза е 1,5-2,0 mg/kg. При повишаване на съдържанието на охратоксин А във фуражите до 5 mg/kg се наблюдават признаци на отравяне и смърт на отделни животни при прасета и пилета.

Токсикодинамика. Не е достатъчно ясно. Охратоксин А действа предимно върху бъбреците, така че в Дания, където тази микотоксикоза е докладвана за първи път при прасета, тя се нарича "микотоксична нефропатия по свинете". Установено е, че охратоксините, влизайки в кръвта, относително бързо се свързват с нейните протеини. Може би, попадайки в киселата среда на бъбреците, микотоксинът се освобождава и проявява своя нефропатичен ефект.

Клиника. Хроничната охратоксикоза, която се среща по-често в практически условия, се проявява много слабо. При животните жаждата се увеличава, полиурията се изразява и наддаването на тегло намалява. В кръвта в някои случаи се отбелязва левкоцитоза, увеличаване на броя на лимфоцитите и намаляване на базофилите. При пилетата се наблюдава общо потискане, разрошени пера и намаляване на производителността. Според някои автори по черупката на яйцата се появяват жълти петна.

Лечение. Няма специфични лечения. На първо място, от диетата трябва да се изключат храни, съдържащи охратоксин А или засегнати от мухъл. Ефективно е въвеждането на различни адсорбенти във фуража, като зеолити, глауконити и др.

патологични промени. Най-характерното за охратоксикозата е увреждането на бъбреците. Като правило те са увеличени, капсулата понякога е свързана с кортикалния слой. На разреза кортикалния слой е блед; под капсулата може да има кисти с размери 1-2 mm. Хистологичното изследване отбеляза некроза на клетките на проксималните тубули, растеж, съединителна тъкан в кортикалния слой.

В коремната кухина понякога се открива повишено съдържание на течност. В някои случаи черният дроб е увеличен и клетките му са некротично променени.

Ветсанекспертиза. При принудително клане на животни при охратоксикоза задължително се изследват органите и тъканите и особено бъбреците за наличие на микотоксин. MRL за охратоксин в месо и карантии не е установен. Ако се открият остатъци от микотоксини, трупът и вътрешните органи се обезвреждат.

Концентрация на охратоксин А в пробата, mg/kg

Граници на относителна грешка (индекс на точност) (±d), %, Р = 0,95

Стандартно отклонение на повторяемостта (s r), %

Граница на повторяемост ( r), %

Пълнота на извличане на веществата, %

4. Измервателни уреди, спомагателни устройства, стъклария, реактиви и материали

4.1. Измервателни инструменти

4.2. Помощно оборудване

Апарат за разклащане на проби тип АВУ-6С или подобен	ТУ 64-1-2451
Ротационен изпарител IR-1M с уловител или подобен	ТУ 25-11917
Лабораторен сушилен шкаф с грешка в поддържане на температурата ±2,5 в диапазона от 50 до 350 °C	ТУ 16-531.639
Хладилник домакински
Електрическа лабораторна мелница EM-3A или подобен pH метър	ТУ 46-22-236-79
Магнитна бъркалка тип ММ 5 с бъркалка	ТУ 25-11.834-80
Конични колби с плоско дъно 250 см 3 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Тъмни стъклени бутилки на винт (вили), обем 7 см 3
Мерителни колби вместимост 100, 500, 1000 cm 3 тип 2-100-2,2-500-2
Лаборатория за фунии
Крушовидни колби 10 см 3 с НШ 14,5 тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72

4.3. Реактиви и материали

Натриев фосфат монозаместен, 2-воден, chda
Натриев хлорид, химически чист
Ацетонитрил, висока степен на чистота 0
Метанол, ощ
Фосфорна киселина, висока чистота	TU 2612-014-00203677-97
Ледена оцетна киселина, химически чиста
Толуен, чда
Имуноафинитетни колони Ochraprep (R-Biopharm, UK)

. Подготовка за вземане на измервания

5.1. Приготвяне на стандартни разтвори на охратоксин А

За да се приготви стандартен разтвор за съхранение (концентрацията на охратоксин А е 10 ng/µl), проба от 5 mg кристален охратоксин А се поставя в мерителна колба с обем 500 cm 3, 50 cm 3 смес от толуен- добавя се оцетна киселина (98:2 об.%), внимателно се разбърква до пълното разтваряне на веществото и същата смес от разтворители се довежда до марката. За да се установи точната концентрация на разтвора за съхранение, неговата оптична плътност се измерва при дължина на вълната 333 nm (D 333). Концентрацията на разтвора се изчислява по формулата:

След това 5 cm 3 стандартен разтвор на охратоксин А с концентрация 10 ng/μl се разреждат със смес от толуен-оцетна киселина (98: 2 об.%) до обем 100 cm 3, като се получава работен разтвор с концентрация 0,5 ng/μl.

За приготвяне на работни разтвори на охратоксин А с концентрация 0,005; 0,05 и 0,1 ng/µl, съответно, 50, 500 и 1000 µl от разтвор с концентрация 0,5 ng/µl се вземат, изпаряват се до сухо и се разтварят в 5 cm 3 от подвижната фаза.

Разтворът за съхранение на охратоксин А се съхранява в стъклен съд с шлифована запушалка на тъмно и хладно място (при температура около 0 °C) до една година и се използва за приготвяне на работни стандартни разтвори. Работните стандартни разтвори се съхраняват в тъмни стъклени флакони на тъмно и хладно място (при температура около 0 °C) в продължение на 1 месец.

Преди да използвате работни стандартни разтвори, те трябва да бъдат доведени до стайна температура и едва тогава да се отворят запушалките.

5.2. Приготвяне на фосфатен буферен разтвор, рН = 7,4

Част от двузаместен натриев фосфат 12-воден разтвор с тегло 1,15 g, част от натриев монозаместен 2-воден разтвор с тегло 0,124 g и порция натриев хлорид с тегло 1,74 g се прехвърлят в мерителна колба с вместимост 100 cm 3, 10 - 20 cm 3 дестилирана вода. Разбъркайте и доведете обема на разтвора в колбата до маркировката. Срок на годност - 1 месец в хладилник.

5.3. Приготвяне на смеси от разтворители

Толуен-оцетна киселина киселина (98:2 % относно.).

В мерителна колба от 1000 cm 3 се добавят 20 cm 3 оцетна киселина и при разбъркване се довежда до марката с толуен. Срок на годност - 1 месец на тъмно и хладно място.

Ацетонитрил-вода (60:40 % относно.).

В мерителна колба от 1000 cm3 се добавят 600 cm3 ацетонитрил и при разбъркване се довежда до марката с вода. Срок на годност - 1 месец на тъмно и хладно място.

Ацетонитрил-вода (60:40 % относно.; pH = 3 ,0 ).

В мерителна колба от 1000 cm3 се добавят 600 cm3 ацетонитрил и при разбъркване се довежда до марката с бидестилирана вода. Чрез добавяне на фосфорна киселина рН на сместа се регулира до стойност, равна на 3,0. Срок на годност - 1 месец на тъмно и хладно място.

метанол-оцетна киселина киселина (98:2 % относно.).

В мерителна колба от 1000 cm 3 се добавят 20 cm 3 оцетна киселина и при разбъркване се довежда до марката с метанол. Срок на годност - 1 месец на тъмно и хладно място.

. Пробовземане и подготовка на пробите за анализ

6.1. Избор на проба

За да се вземат предвид спецификите на вземане на проби от определени видове продукти, трябва да се ръководи от действащата нормативна и техническа документация:

„Царевица. Правила за приемане и методи за вземане на проби” GOST 13586.3-83;

„Крупа. Правила за приемане и методи за вземане на проби” GOST 26312.1-84;

„Брашно и трици. Методи за приемане и вземане на проби” GOST 27668-88;

„Консервирани хранителни продукти. Вземане на проби и подготовката им за изпитване” ГОСТ 8756.0-70.

Проби за анализ, представителни за концентрацията на микотоксини за цялата партида, трябва да се вземат от предварително хомогенизирана средна (първоначална) проба с тегло 2 kg.

6.2. Подготовка на пробите за анализ

Избраните проби се раздробяват за 1 - 2 минути в лабораторна мелница. В този случай се използват две паралелни проби.

6.2.1. Екстракция

Порция от 25 g от натрошената проба се поставя в 250 cm плоскодънна конична колба, добавят се 100 cm 3 смес от ацетонитрил-вода (60:40% об.). Екстрахирайте в шейкър за 30 минути. Получената смес се филтрира през нагънат хартиен филтър със синя лента. Избират се 10 cm 3 от филтрата и се добавят 90 ml разтвор на фосфатен буфер, рН = 7,4.

6.2.2. Пречистване на екстракта

100 ml от получената смес се нанасят върху имуноафинитетната колона със скорост 1 - 2 капки в секунда, промиват се с 20 cm 3 разтвор на фосфатен буфер, рН = 7,4. Охратоксин А се елуира с 3 cm 3 смес от метанол-оцетна киселина (98:2 об. %).

. Вземане на измервания

7.1. Подготовка на пробна проба

Елуатът се изпарява до сухо. Сухият остатък се разтваря в 400 μl подвижна фаза (разтвор А).

7.2. Хроматографски условия

HPLC условия: подвижна фаза - ацетонитрил-вода (60:40% vol.; pH = 3.0); скорост на подвижната фаза - 1,5 cm 3 /min.

Флуориметричният детектор е настроен на дължина на вълната на възбуждане от 333 nm, емисионен филтър с честотна лента от 466 nm е инсталиран на емисионната линия.

За анализ на пробата 50 μl от тестовата проба (разтвор А) се инжектират в инжектора на хроматографа с помощта на микроспринцовка. При наличие на пик, съвпадащ с времето на задържане на охратоксин А, масата на охратоксин А в инжекцията се изчислява с помощта на калибровъчна крива.

. Обработка на резултатите от измерванията

8.1. Изграждане на градуирана зависимост

За да се изгради калибрационна графика, се извършва хроматографски анализ на серия от работни разтвори на стандарти. С помощта на микроспринцовка в инжектора се инжектират 50 µl работен стандартен разтвор с концентрация 0,005 ng/µl, което съответства на 0,25 ng охратоксин А. Същото се прави и за други стандартни разтвори с концентрации 0,05 и 0,10 ng/ µl, което от своя страна съответства на 2,5 и 5,0 ng охратоксин А на инжекция. При тези условия времето на задържане на охратоксин А е от порядъка на 4 до 5 минути. Въз основа на получените данни се изгражда графика за калибриране (зависимост на площта на хроматографския пик от масата на охратоксин А в инжекцията).

8.2. Регистрация на резултатите

Изчисляването на концентрацията на охратоксин А в пробата се извършва по формулата:

C (защита A)- концентрация на охратоксин А в пробата, mg/kg;

М- тегло на пробата за анализ, g (25,0);

Tе масата на охратоксин А, съответстваща на обема на разтвор А, въведен в хроматографа, ng;

V 1 - обем на разтвора за екстракция, cm3 (100);

д - граница на абсолютна грешка:

д - граница на относителната грешка на техниката (индекс на точност), % (Таблица 1).

Ако съдържанието на охратоксин А в пробата е по-малко от долната граница на обхвата на определените концентрации, резултатът от анализа се представя като:

* 0,0001 mg/kg - граница на откриваемост.

8.3. Проверка на приемливостта на резултатите от паралелни определяния

Допустимо несъответствие между паралелни измервания (Р) се определя въз основа на границата на повторяемост (r) (Маса 1):

Р = 0,01 (r, %) × , mg/kg

Ако несъответствието между паралелните дефиниции не надвишава допустимото:

тогава средноаритметичното се приема като резултат от анализа.

При надвишаване на стандартаРизмерванията трябва да се повторят, като се използват резервни проби.

. Контрол на качеството на резултатите от измерванията

Честотата на контрола на грешката на измерването зависи от броя на работните измервания за контролирания период и се определя от плановете за контрол.

Контролните проби са работни проби от хранителни суровини и хранителни продукти. Взема се проба и се разделя на 2 равни части. Едната се оставя непроменена, а към другата се добавя такова количество стандартен разтвор на охратоксин А, че масовата му част в пробата да се увеличи с 50 - 100% спрямо първоначалната стойност. Добавката трябва да се въведе в пробата преди началото на подготовката на пробата.

И двете проби се анализират в строго съответствие с предписанието на методиката и се получават резултатите от анализа на оригиналната проба ( C (отрицателен A)) и проби с добавка ( СЪС ¢ (отрицателен A)). Определянето се извършва при едни и същи условия, а именно: анализът се извършва от един анализатор, като се използва един набор мерителни прибори, реактиви, разтвори и др.

Алгоритъмът за провеждане на контрол на оперативната грешка с помощта на адитивния метод се състои в сравняване на резултата от контролното определяне, което е равно на разликата между резултата от контролното измерване на пробата с добавката ( СЪС ¢ (охра)), проби без добавка ( C (защита A)) и стойността на добавката ( C ext (arm.A)) със стандарт за оперативен контрол (К). Решението за задоволителна грешка се взема, когато е изпълнено следното условие (когато R и

Околна температура от 15 до 25 °С.

Относителна влажност на въздуха не повече от 80% при 25 °С.

Атмосферно налягане 730 - 760 mm Hg.

Захранващо напрежение: 210 - 220 V. AC честота: 45 - 50 Hz.

Брошура

Комплекти и са тест системи за ензимен имуноанализ. Предлагат се в търговската мрежа в съответствие с ISO 9000 в комплект с необходимите реагенти и са предназначени за количествено определяне на охратоксин в зърнени култури, фуражи, зърнени продукти, бира и кръвен серум. Указания за използване на тестови системи RIDASCREEN® FAST Охратоксин АИ RIDASCREEN® Охратоксин Аодобрен от отдела по ветеринарна медицина на Федералната агенция по земеделие на Министерството на земеделието на Русия под номер МУК 5-1-14/1001.Системите са включени в „Списък на нормативната документация, разрешена за използване в държавни ветеринарни лаборатории при диагностициране на болести по животни, риби, пчели, както и за наблюдение на безопасността на суровини от животински и растителен произход“. Тест системи RIDASCREEN® FAST Охратоксин Акореспондирам ГОСТ 34108-2017"Фураж, смесени фуражи, смесени фуражни суровини. Определяне съдържанието на микотоксини чрез директен твърдофазов конкурентен ензимен имуноанализ".

Определяне на охратоксин А в зърно, фуражи, зърнени продукти, бира и кръвен серум

Охратоксинът е отровно вещество, образувано в резултат на жизнената активност на плесенните гъбички от рода АспергилусИ Пеницил. Наред с изразената нефротоксичност, охратоксинът има хепатотоксични, тератогенни, канцерогенни и имуносупресивни свойства. С продукти от растителен и животински произход охратоксинът може да попадне в човешкото тяло. Открива се не само в зърнените храни (13% от положителните проби) и храната за животни, но и в свинската кръв (60% от положителните проби) и бъбреците (21% от положителните проби).

Технически регламенти на Митническия съюз TR CU 021/2011 "Относно безопасността на храните"регулират следното максимално ниво на съдържание на охратоксин А: в хранителни зърна, зърнени култури, брашно - 0,005 mg / kg (5 μg / kg); в бебешка храна, хранителни продукти за предучилищна и училищна възраст, хранителни продукти за бременни и кърмещи жени - не се допускат (<0,0005 мг/кг).

Проект на федерален закон № 349084-5 „Техническият регламент за лозаро-винарските продукти“ установява изисквания за съдържанието на охратоксин А във виното не повече от 0,002 mg/l.

Проектът на федерален закон „За изискванията за безопасност на хранителните продукти и процесите на тяхното производство, съхранение, транспортиране, продажба и унищожаване“ също включва изискване за задължителен контрол на хранителните зърна за охратоксин А, чието съдържание не трябва да надвишава 0,005 mg /килограма. Актуалните правни разпоредби можете да намерите на уебсайта compact24.com.

Доскоро хроматографските методи (високоефективна течна хроматография, тънкослойна хроматография) се използваха предимно за контрол на охратоксина. Много по-удобен метод на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA или ELISA), който има много висока чувствителност.

Спецификация:	RIDASCREEN® FAST Охратоксин А	RIDASCREEN® Охратоксин А 30/15
формат:	Плака с лента, 48 ямки (6 ленти по 8 ямки)	Плака с лента, 96 ямки (12 ленти по 8 ямки)
Стандарти:	0 / 5 / 10 / 20 / 40 µg/l	0 / 50 / 100 / 300 / 900 / 1800 ng/l
Приготвяне на пробата:	Смилане на пробите, екстракция, филтриране	екстракция, центрофугиране/филтриране (зърно, фураж); екстракция, центрофугиране, филтриране, разклащане, свръхекстракция, центрофугиране, изпаряване (бира/серум)
Прекарано време:
Граница на откриване:	0,005 mg/kg	0,001250 mg/kg (зърно, фураж) 0,000050 mg/kg (бира, кръвен серум)

Свързани продукти: